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2026
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案例分享 | 实测信号提升 10 倍！柱后丙酸-异丙醇体系消除 TFA 质谱抑制效应
做多肽制备的小伙伴一定遇见过两难困境：若不添加三氟乙酸（TFA），多肽峰形拖尾严重，分离度欠佳；若添加0.1%
做多肽制备的小伙伴一定遇见过两难困境：
若不添加三氟乙酸（TFA），多肽峰形拖尾严重，分离度欠佳；
若添加0.1% TFA 以改善峰形，ESI 质谱又会遭受严重的离子抑制，目标物信号近乎消失，导致无法利用在线质谱定位并收集目标馏分。
长期以来，TFA 的分离优势与质谱检测灵敏度始终相互制约，二者难以同步兼顾。本文依托 TFA-Fix 柱后补偿液体系，打通含 TFA 流动相与在线质谱的联用壁垒，实现分离、质谱检测一体化。
01
矛盾根源：TFA的双刃剑效应
在反相快速纯化中，0.1% TFA 是多肽分离的经典添加剂：
优势：消除峰拖尾，提升分离度，在214nm基线平稳。
致命缺陷：TFA 阴离子极易与质子化多肽形成中性离子对，严重抑制 ESI离子化效率，同时导致质谱基线噪声飙升，目标峰信号被淹没，在线质谱无法实时指引馏分收集。
传统折中方案均存在明显短板：
弃用TFA：会导致峰形变差，杂质与目标肽共流出，纯化纯度无法达标；
收集馏分后离线质谱检测：操作繁琐、时效性差，无法自动化触发收集，且样品损耗大。
02
破局利器：TFA-Fix 柱后补偿方案
既然TFA不能不用，质谱信号又不能丢，那就在柱后做文章！本次实验基于 puriFlash® 5.250P 制备色谱系统 + expression CMS质谱系统，验证丙酸 - 异丙醇柱后补偿液对 TFA 的抑制修复效果，建立一套可同步保留 TFA 分离优势、实现在线质谱精准识别的完整标准化流程。
1、仪器与色谱条件
2、两组对照实验（仅柱后补偿液不同）
对照组（无 TFA-Fix）：添加异丙醇作为柱后补偿液
实验组（有 TFA-Fix）：添加丙酸：异丙醇 = 25:75 柱后补偿液
3、实验原理
丙酸酸性弱于 TFA，柱后与 TFA 发生竞争结合，替换多肽表面的三氟乙酸根，释放质子化多肽离子；同时高比例异丙醇提升了 ESI 源脱溶剂效率，双重抵消 TFA 的离子抑制，质谱检测灵敏度大幅回升。
03
实测结果对比，差距一目了然
1、UV 信号：不受影响，分离优势完整保留
柱后补偿液添加位置在紫外检测器下游，不会改变色谱分离行为。两组 UV 谱图在峰形、峰高、出峰时间一致，TFA 优化分离的优势完整保留。
图1：有无TFA-Fix的UV谱图对比
2、质谱信号：从“几乎看不见”到“清晰可辨”，信号提升近10倍
对照组（未添加 TFA-Fix 柱后补偿液）
三种多肽的XIC基线杂乱，噪声高，目标峰微弱，难以区分目标物与杂质；
TIC总离子流基线持续抬高，无法满足在线分馏收集的判定标准。
异丙醇仅起稀释作用，无法置换与多肽结合的TFA阴离子，抑制效应未被解除。
实验组（添加 TFA-Fix 柱后补偿液）
三种多肽 XIC 信号强度直接提升 10 倍；
基线背景噪声大幅降低，峰形尖锐对称；
TIC 总离子流基线平滑，响应全面改善。
谱图解读（是否添加 TFA-Fix 柱后补偿液）
以下图谱展示了是否添加 TFA-Fix 柱后补偿液的对比，可以看出 XIC 谱图信号明显恢复，TIC 总离子流的基线也显著改善。
图2：二肽，有无添加 TFA-Fix 的 XIC 谱图对比
图3：三肽，有无添加 TFA-Fix 的 XIC 谱图对比
图4：甲硫氨酸脑啡肽，有无添加 TFA-Fix 的 XIC 谱图对比
图5：有无添加 TFA-Fix 的 TIC 谱图对比
04
实验核心结论
含三氟乙酸（TFA）的流动相与电喷雾离子化（ESI）质谱天然不兼容，直接联用将导致质谱信号显著衰减。为此，本方案采用柱后补偿技术，引入丙酸/异丙醇（25/75，v/v）的 TFA-Fix 补偿液，在不改变原有成熟色谱梯度的前提下，有效消除离子抑制作用。该策略兼顾了 TFA 带来的优异多肽分离度与在线 ESI-MS 的灵敏检测能力，从而实现全自动化的靶向馏分收集。
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